Estrusione meccanosensibile di Enterovirus A71

Nature Microbiology volume 8, pagine 629–639 (2023) Citare questo articolo

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L'Enterovirus A71 causa una malattia grave in seguito a infezione sistemica, che talvolta porta a disfunzioni neurologiche potenzialmente letali. Tuttavia, nella maggior parte dei casi l’infezione è asintomatica e limitata al tratto gastrointestinale, dove il virus viene amplificato per la trasmissione. In precedenza è stato dimostrato che i picornavirus escono dalle cellule infette tramite la lisi cellulare o la secrezione di vescicole. Qui riportiamo che intere cellule infette da Enterovirus A71 sono specificamente estruse dalla superficie apicale di organoidi differenziati del colon umano, come osservato mediante microscopia confocale. La sensibilità differenziale agli inibitori chimici e peptidici ha dimostrato che l'estrusione di cellule infettate da virus dipende dal rilevamento della forza tramite canali ionici meccanosensibili piuttosto che dalla morte cellulare per apoptosi. Quando isolate e utilizzate come inoculo, le cellule estruse contenenti virus intatte possono avviare nuove infezioni. Al contrario, quando il rilevamento della forza meccanica viene inibito, vengono rilasciate grandi quantità di virus libero. Pertanto, l’estrusione di cellule vive infette da virus dal tessuto epiteliale intatto può apportare benefici sia all’integrità dei tessuti dell’ospite che alla diffusione protetta di questo patogeno oro-fecale all’interno e tra gli ospiti.

La questione di come i virus della progenie lasciano una cellula o un tessuto infetto è vitale per la nostra comprensione della diffusione virale in un ospite infetto e tra ospiti. Per decenni si è pensato che i picornavirus, in quanto virus senza involucro o “nudi”, si trasmettessero esclusivamente per via litica, attraverso la drammatica rottura della cellula infetta. Il rilascio litico di picornavirus da linee cellulari di colture di tessuti standard determina un'ampia dispersione dei virioni per avviare successivi cicli di infezione. Tuttavia, per diversi picornavirus è stata dimostrata una diffusione non litica, durante la quale i virus si appropriano delle membrane intracellulari per facilitare il loro rilascio dalle cellule intatte, avvolte all'interno di vescicole extracellulari1,2,3,4. Una conseguenza di questa strategia di trasmissione è che, invece della diffusione dispersiva delle singole particelle virali, i virus vengono trasmessi in blocco all’interno di pacchetti membranosi5.

I modelli organoidi epiteliali sono strumenti interessanti per esaminare le risposte tessuto-specifiche agli insulti patogeni6,7. Gli organoidi sferici 3D derivati ​​da cellule staminali adulte possono essere differenziati per ricapitolare la diversità dei tipi cellulari presenti nei tessuti nativi8. Gli organoidi crescono tipicamente con la superficie apicale rivolta verso i compartimenti luminali interni. Monostrati o organoidi polarizzati 2D tagliati meccanicamente per consentire l'accesso apicale dell'Enterovirus A71 (EV-A71) sono stati utilizzati per modellare l'infezione da EV-A71 dell'epitelio gastrointestinale9,10,11. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per invertire la topologia organoide per presentare direttamente la superficie apicale degli epiteli gastrointestinali ai patogeni enterici preservando l'integrità epiteliale12,13. In questo articolo, questi organoidi apicali vengono utilizzati per monitorare l'infezione delle cellule epiteliali da parte di EV-A71 e i successivi meccanismi di diffusione virale in questo tessuto.

Eravamo interessati a utilizzare organoidi epiteliali gastrointestinali apicali come modello di infezione da EV-A71 in cui viene mantenuta l'integrità della barriera epiteliale. Abbiamo scelto di utilizzare organoidi derivati ​​dal tessuto del colon (colonoidi), a causa della vicinanza del colon all'uscita virale da un ospite infetto, per comprendere meglio la trasmissione dell'EV-A71. I colonoidi derivati ​​dal tessuto della cripta umana adulta sono stati coltivati ​​su impalcature della membrana basale in presenza di fattori staminali, tra cui WNT e R-spondina, generando sferoidi di cellule staminali con la superficie basolaterale rivolta verso l'esterno e le superfici apicali e lumenali rivolte verso l'interno. Cinque giorni prima dell'infezione, i colonidi sono stati rimossi dallo scaffold della membrana basale e mantenuti in coltura in sospensione in assenza di matrice per indurre l'inversione della topologia degli organoidi in modo che le superfici apicali fossero all'esterno degli organoidi (apicale-out)12. Allo stesso tempo è stato applicato il terreno per indurre la differenziazione cellulare. In questi colonoidi umani apicali, abbiamo monitorato l'organizzazione del citoscheletro di actina e del recettore EV-A71 SCARB2 (Fig. 1a). La superficie apicale dei colonoidi ben differenziati e polarizzati contiene microvilli con orlo a spazzola, facilmente identificabili con la colorazione F-actina come uno spesso strato ricco di actina. SCARB2 è una proteina integrale della membrana lisosomiale che cicla sulla superficie apicale dei monostrati polarizzati14,15 ed è stata abbondantemente espressa in questi colonoidi apicali (Fig. 1a).